图2 ddPCR反应流程

而Iehara等 [4]应用微滴数字PCR（ddPCR）评估NB患者cfDNA的MYCN基因扩增状态，其灵敏度及特异度均为100%。因此，对于难以获得肿瘤组织标本的患者，可通过cfDNA检测评估MYCN基因扩增状态，对其危险分层的预测具有临床价值 。

张翼鷟 教授 中山大学肿瘤防治中心

图1 从外周血浆中提取细胞游离DNA并捕获5hmC

MYC-N扩增作为NB的生物标志物，其扩增比例占NB患者的20-30%，与高疾病风险和不良预后密切相关。荧光原位杂交（FISH）是目前临床实践中常用于检测MYCN拷贝数变化的方法。然而，此方法需患者提供组织标本，且一般为手术或活检的标本，部分无法手术或提供活检组织较少的患者则难以进行；此外，此方法还可能导致重复活检，对晚期患儿而言耗时且痛苦。

2.Bonner E R, Bornhorst M, Packer R J, et al. Liquid biopsy for pediatric central nervous system tumors. npj Precision Oncology, 2018, 2(1): 1-9.

神经母细胞瘤（NB）是婴幼儿中最常见的颅外实体瘤，其具有高度异质性，易发生远处转移，且原发性肿瘤与其转移性病变的分子特征常不一致，传统的组织活检已无法满足临床诊疗需求 。此次《医师报》特别邀请到中山大学肿瘤防治中心儿童肿瘤科张翼鷟教授为我们介绍液体活检联合表观遗传学分析在神经母细胞瘤诊疗中的应用价值。

此种检测方法原创于芝加哥大学，通过Nano-5hmC-Seal测序技术实现（图1）。Applebaum等 [3]应用Nano-5hmC-Seal测序技术对NB患儿在其疾病过程中的不同时间点（诊断、治疗期间和随访）的5-羟甲基胞嘧啶谱进行分析，结果表明NB患儿的cfDNA中5-羟甲基胞嘧啶增加与转移相关，可以作为治疗反应和预后的预测指标。

液体活检联合表观遗传学分析已成为NB诊断的新方法，但目前各种液体活检技术尚不完善，仍有极大发展空间。相信随着研究的不断深入，未来临床将更成熟地应用液体活检技术，推动实现更精准的个体化治疗，为患者带来更高生存获益。

NB起源于交感神经节或双侧肾上腺，是婴儿与儿童最常见的颅外实体肿瘤 ，超过50%的NB发生于2岁以内的婴幼儿，该肿瘤在全部儿童肿瘤疾病中占6%～10%，死亡率约为15% [1]。NB易发生远处转移，约2/3的患者确诊时已为晚期，其常见转移部位包括淋巴结、骨髓、骨、肝脏、皮肤等。

液体活检在表观遗传学水平对肿瘤的负荷、复发和转移进行评估是生物医学研究的潜力领域。细胞游离DNA（cfDNA）是指细胞转化为生物液体过程中释放的DNA片段，可以通过基于PCR技术或者下一代基因组测序(NGS)技术检测出 [2]。NB易发生远处转移，且晚期高危患者预后不佳，而血浆cfDNA的表观测序极有可能作为NB的早期诊断、疗效预判、复发监测和预后判定的新标志物。

此外，如何实时监测药物疗效或早期判断是否耐药已成亟待解决的课题。通过外周血液体活检可监测临床疗效，调整治疗方案，对患者进行最大受益的治疗，是提高患者生存的有效手段。研究显示，外周血中cfDNA的突变情况可监测患者对治疗的反应，为实时监测疗效提供了生物标志物 。

本团队的近期研究，创新性通过5hmC结合PCR(5hmC-ddPCR)的方法，检测NB患者cfDNA中单个羟甲基化位点，准确判断MYCN在NB患者中的扩增状态。5hmC-ddPCR为非侵入性，具有高度敏感性与特异性，可作为一种精确且无创的方法以鉴别具有MYCN扩增的NB患者。尽管FISH仍是目前临床判断MYC-N是否扩增的金标准，但具有局限性；目前团队正致力于5hmC-ddPCR技术的优化，希望未来可助力NB的诊断及预后判断。

当前临床基于不同的危险度分组治疗NB。近年来, 肿瘤的治疗方式多采用多学科综合治疗, 如手术治疗、化疗、核医学治疗、免疫治疗等 。低危组或中危组患儿可获得良好预后，长期无瘤生存率可达90%。而高危组患儿预后差，即使经过综合治疗，长期无瘤生存率仍不及50%，后期易复发或发生远处转移 ，开发新的诊疗技术已成亟待解决的重要问题。

4.Iehara T, Yagyu S, Gotoh T, et al. A prospective evaluation of liquid biopsy for detecting MYCN amplification in neuroblastoma patients. Jpn J Clin Oncol. 2019 Aug 1;49(8):743-748.

液体活检在广义上是指以血液为主的体液标本中细胞及核酸的检测，已成当前肿瘤研究领域的热点之一。

MA, Barr EK, Karpus J, et profiles in circulating cell-free DNA associate with disease burden in children with neuroblastoma. Clin Cancer Res,2020,26(6):1309-1317.

1.Irwin MS,Park JR. Neuroblastoma:Paradigm for precision medicine. Pediatr Clin North Am,2015,62(1):225-256.